DDC科技日 | 纽甜的检测，合成方法和代谢途径综述

摘要：纽甜属于二肽类强力甜味剂，是阿斯巴甜的衍生物，它是迄今为止世界上最甜的合成甜味剂。主要介绍了新一代强力甜味剂-纽甜的性质，合成方法和代谢途径的研究进展。

关键词：纽甜，阿斯巴甜，甜味剂，3,3- 二甲基丁醛

纽甜（Neotame，简称NTM），学名为N-[N-（3，3-二甲基丁基）-L-a-天冬氨酸]-L-苯丙氨酸1-甲酯，是美国孟山都（Monsanto）公司和法国里昂大学合作开发的新型、高效、安全、非营养型甜味剂[1]。纽甜的结构式见图下图。

1 纽甜的特性

纽甜的甜味与阿斯巴甜相近，无苦味及其它后味，纽甜的甜度高，为蔗糖的8000-10000倍，即在5%的甜度时为蔗糖的8000倍，在2%的甜度时可达蔗糖的10000倍。根据GB2760-2014食品添加剂卫生标准，纽甜的使用范围为各类食品饮料，使用量为按生产需要适量使用。一般饮料类8~17mg/L，食品类10~35mg/Kg。在普通或无糖的饮料中，以纽甜替代部分甜味剂使用，不仅可得到适宜甜度和风味的产品，纽甜更具有降低产品成本的特性。甜味纯正，清新自然，安全性较高；等甜度成本较阿斯巴甜低；所含的营养物质很容易被人体吸收；低能量或无能量、可供糖尿病人食用、不致龋齿、可促进双歧杆菌增殖等；不会引起蛀牙、血糖波动，是保健型食品的首选甜味剂。

1.1纽甜的物理化学性质

纽甜是一种白色粉状结晶，含约4.5%的结晶水，熔点为80.9~83.4 ℃，25℃时NTM在水中的溶解度为12.6g /L，与相似；但在乙醇中的溶解度为950g /L，大大高于阿斯巴甜在相同条件下的溶解度。NTM 结构中含有羧基和亚氨基，是两性化合物，其pKa值分别为3.03和8.08，等电点为5.5。所以NTM既可形成酸式盐，也可形成碱式盐，并可与金属形成复合物，从而改善其稳定性和其它特性[1]。

1.2稳定性

纽甜在干粉状态下，在粉末状成品中具有极佳的稳定性。在湿度条件下，纽甜的稳定性与PH值、温度和时间有关。纽甜适用于分批生产、高温短时(HTST)杀菌和无菌操作过程，得到的终产品中纽甜的浓度几乎没有改变。在酸性条件下，纽甜具有与阿斯巴甜大致相同的稳定性。在中性PH范围或瞬时高温等条件下，纽甜要比阿斯巴甜稳定得多，这大大扩大了其应用领域，如在焙烤食品中的应用。纽甜的稳定性取决于贮存的时间、温度、氧化还原环境和酸碱度。干粉状的纽甜其化学稳定性至少有５年，而液态状纽甜的稳定性则随不同的用途而变动。纽甜在高浓度双氧水，碱性条件下则不稳定，保留率较低。为此，在纽甜的多方面应用范围内，应尽量避免在碱性和强氧化性的条件下使用[2]。常温下(25℃)在水溶液中的稳定性，大致为:pH3.0时半衰期为78天；pH4.0时半衰期为156天；pH4.5时半衰期为208天；pH5.0时半衰期为150天；pH5.5时半衰期为112天。最佳pH为4.5。鉴于此，纽甜的使用如果与蔗糖或者其它甜味剂配合使用，可以提高其稳定性。

1.3风味延长

在特定的应用和风味体系中，纽甜可显著地延长、增强产品的口感和香味。纽甜在实际应用过程中，因其修正和某些风味的特性，要求产品重新调整香精体系和酸味剂的含量或种类。在粉末饮料中，添加纽甜可减少至少20%的柠檬酸用量，而不会影响产品的酸味。纽甜和蔗糖配合使用时，特别是当纽甜替代10%~20%的蔗糖时，生产出口味更易被接受的产品，其口感优于完全使用蔗糖生产的产品[3]。

1.4安全性

大量的研究结果表明，纽甜适用于包括儿童、孕妇、哺乳期妇女和糖尿病患者在内的所有人群。使用纽甜无需对苯酮尿症患者特别表明。纽甜在体内可迅速新陈代谢。主要的代谢途径是通过人体产生的酶使甲酯水解，最后生成脱脂纽甜甜和甲醇。相比于普通食品如果汁、蔬菜、和蔬菜汁，纽甜所分解生成的甲醇量微乎其微。例如，番茄汁中甲醇含量超过含纽甜饮料的200倍。纽甜可随尿液和粪便彻底地排除体外，不会在人体内积聚。纽甜有很好的代谢范畴，在体内很快的分解为脱酯化的纽甜和很少量的甲醇。纽甜和脱酯化的纽甜通过机体的正常处理被很快的排出体外，而在体内没有积蓄。用各种不同的动物种属所作的广泛的临床前期安全性试验确定了纽甜的安全范围是数千倍于预测的人类接触水平。人体的耐受试验认定了纽甜是安全的并且在剂高达15倍于第90百分位的预测用量时仍能被很好的耐受。动物试验所显示出的安全范围和已确认的人体安全性肯定了纽甜作为一种增甜剂和强味剂是安全的，可以用于各种不同的食品和饮料中[4]。

1.5在动物饲料中应用

纽甜能有效地遮蔽糖精的后苦，提高饲料的适口性。牲畜的日食量是决定牲畜生长速度的主要因素，特别是仔猪、乳猪日采食量，影响了牲畜整个的生长过程，因此改善饲料的适口性，来增加他们的日采食量，从而加速牲畜的生长速度。牲畜，尤其是幼猪、乳猪的味觉比人类更敏感。纽甜以下特征，可弥补和改善饲料甜味剂:纯净的甜味，没有苦、涩、金属的异味;较长的后甜可掩盖糖精的苦味和金属味，改善饲料的口感特性，掩盖异味，与糖精14~24%协同增效作用，以0.05~0.1%添加量用于低档饲料，以0.15~0.25%添加量用于中档饲料，以0.3%以上添加量用于高档饲料。

1.6法规状况

2 纽甜检测方法现状

目前，许多研究者采用各种不同分离检测方法研究纽甜，主要包括高效液相色谱法[5-8]、气相色谱法[9-10]、毛细管电泳法[11]、液相色谱-质谱法[12-13]等。我国国家标准检测方法为GB/T 23378-2009“食品中纽甜的测定方法高效液相色谱法”[14]，国家标准GB29944-2013也规定了食品中纽甜的检测方法为高效液相色谱法。

2.1 LC-MS-MS对食品中纽甜进行检测

目前国家标准检测方法存在灵敏度和基质干扰问题，且食品成分复杂，容易产生干扰，测定过程中容易出现假阳性[15]。采用LC-MS-MS对食品中纽甜进行检测，方法操作简便、灵敏度高、重复性好、适用于食品中纽甜的检测[16]。方法采用C18固相萃取小柱对样品进行净化, 以0.1%甲酸-甲醇溶液为流动相, 梯度洗脱, 电喷雾(ESI) 进样方式, 多反应监测(MRM) 方式对目标离子进行监控, 在正离子化模式下对特征离子峰[M+H]+379 (m/z)和二级特征离子峰172, 319和120 (m/z)进行定量检测。该方法标准曲线的线性相关系数大于0.998, 检出限0.01 mg/kg, 样品的加标回收率在84.6%~101.5%之间, 样品重复性试验的相对标准偏差在5%以内。

2.2 毛细管电泳法检测非酒精饮料中纽甜

测定非酒精饮料中纽甜含量的毛细管区带电泳方法，采用固相微萃取对样品进行前处理。在优化电泳条件下：20 mmol L-1硼砂缓冲溶液，pH 8.025 kV，30mbar下压力进样5s，紫外检测波长191nm，纽甜在5min内出峰。该方法成功用于检测两种饮料中的纽甜含量。可以成为HPLC的一种良好替代方法[17]。

2.3超高效液相色谱串联质谱同时测定酒类产品中多种人工合成甜味剂

超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（ultra performance liquid chromate gramphy-electro spray ionization tandem mass spectro -metry，UPLC-ESI-MS-MS）同时测定酒类产品中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜和纽甜人工合成甜味剂的分析方法。方法采用ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（100 mm×4.6 mm，1.8 μm）色谱柱，柱温50 ℃。流动相由A（甲醇）和B（体积分数0.1%甲酸和20 mmol/L甲酸铵溶液，pH 4.0）组成，流速为0.5 mL/min，梯度洗脱。在ESI负离子模式下，采用多反应监测模式进行测定，可以在12.5 min内完成7 种人工合成甜味剂的检测。该方法快速、准确，灵敏度高，适用于酒类产品中低含量人工合成甜味剂的测定[18]。

2.4 高效液相色谱法检测乳品中纽甜

高效液相色谱方法分析乳制品中安赛蜜，阿斯巴甜和纽甜。样品用沉淀剂沉淀过滤后，以乙腈-磷酸二氢钠溶液为流动相，C18反相色谱柱分离，紫外检测器210nm检测.结果表明：3种甜味剂可在25min之内实现完全分离.用于乳制品中5种甜味剂的测定，灵敏度高，定量准确，节省时间和成本[19].

2.5高效液相色谱法检测饲料甜味剂中纽甜

对于饲料甜味剂中的纽甜检测也可以采用高效液相色谱法，样品用蒸馏水稀释后，以甲醇-蒸馏水溶液为流动相，C18反相色谱柱分离，紫外检测器214nm检测.10min钟以内即可出峰，.用于饲料甜味剂的测定，灵敏度高，定量准确快速，节省时间和成本。

3 纽甜的合成现状

纽甜的合成主要是通过阿斯巴甜和3, 3 -二甲基丁醛的氢化还原反应、纽甜酯的酶法水解和用唑啉酮和L -苯丙氨酸甲酯反应来制备。其中催化还原剂主要使用钯，铂等金属催化剂，最常用的就是钯碳催化剂。

3.1 中间体3,3-二甲基丁醛的合成及纯化

由于纽甜合成原料主要是阿斯巴甜和3,3-二甲基丁醛, 而阿斯巴甜在市场上很容易买到，3,3-二甲基丁醛则是纽甜合成的关键。3,3-二甲基丁醛制备方法有：①有 3,3 -二甲基丁醇氧化制备。②1-氯–3,3-二甲基丁烷氧化制备。③1,1-二氯–3,3 -二甲基丁烷高温水解制备。3,3-二甲基丁醛的粗品必须经过纯化才能与阿斯巴甜氢化还原，否则粗品中含有的杂质和毒害催化剂降低催化效率。其纯化主要是通过与饱和亚硫酸钠形成加和物沉淀分离出来，在把加和物加入碳酸氢钠水溶液或其他的酸碱溶液使醛解析出来，从而得到纯化，此纯化的醛基本上能满足氢化还原反应。

3.2氢化还原法合成纽甜

纽甜的化学合成主要是通过阿斯巴甜与3,3 -二甲基丁醛经催化氢气还原的N-烷基化反应而制得。其反应原理主要是首先3,3 -二甲基丁醛的醛基和阿斯巴甜的末端活性氨基缩合反应生成亚胺，再通过催化剂在氢气的条件下把亚胺的双键还原就得到纽甜。

Nofre等[20]用钯或铂碳催化剂在醇的水溶液中进行N -烷基化的还原反应。阿斯巴甜和3,3 -二甲基丁醛分别加入到甲醇和0.1M的醋酸溶液中保持 pH4.45，碳钯催化氢化还原反应。反应结束后过滤去除催化剂，如有必要用1N的氢氧化钠溶液把滤液调到pH 5, 滤液在旋转蒸发器上去除甲醇，在此过程中白色沉淀迅速产生。去除甲醇后，把剩下的混合物在室温下搅拌数小时使沉淀完全，然后过滤，干燥，用正己烷冲洗。得到纯度大于 98%的纽甜。Prakash等[17]在甲醇中催化剂还原N -烷基化的反应来制备纽甜。阿斯巴甜和3,3 -二甲基丁醛加入到甲醇中，再加入碳钯催化剂，在pH5.0-5.5，并保持一定温度和压力的条件下反应12-16h。反应结束后过滤去除催化剂，用甲醇再冲洗滤渣数次，合并滤液在旋转蒸发去除甲醇至原来体积的一半。然后加入同体积的水搅拌，蒸馏再去除一部分甲醇。剩下的甲醇水溶液在10-15℃下搅拌，过滤并水洗其中的白色沉淀物，在40℃条件下真空干燥，得到纯度大于 97%的纽甜。

Boesten等[21]催化还原N-苄氧羰基-L-α-天冬氨酰]-L-苯丙氨酸-1-甲酯和3, 3-二甲基丁醛制备纽甜。一定量的 N -苄氧羰基-L-α-天冬氨酰]-L-苯丙氨酸-1 -甲酯和3, 3-二甲基丁醛加入到甲醇和甲基异丁基甲酮的混合溶剂中,用碳钯催化还原。反应结束后,过滤去除催化剂,去除有机溶剂。然后冷却结晶得到目标产物纽甜。可以用冷水冲洗或重结晶获得更高纯度的纽甜，晶体在 80℃以下减压干燥。干燥温度高于80℃可能会导致纽甜的分解或副产物的形成。

3.3 化学酶法制备纽甜

Prakash等利用脂肪酶或酯酶立体选择性催化氢解纽甜酯制备纽甜。纽甜酯的合成通常有四种方法：①利用多肽缩合剂试剂，如二环己基碳二亚胺( DCC ) 、( CD I) 、卡特缩合剂( BO P) 等等,但是这些试剂的价格非常昂贵,不适合工业化的生产。②通过N-(3，3-二甲基丁基)-L-α-天冬氨酸-β-酯酰氯和L-苯丙氨酸甲酯缩合来制备，反应过程中要通过通入HCl气体使反应液保持酸性防止L-苯丙氨酸甲酯的自身缩合。③通过N-(3, 3-二甲基丁基)-L-α-天冬氨酸-β-酯酸酐和L-苯丙氨酸甲酯缩合来制备。N-( 3, 3 -二甲基丁基)- L-α-天冬氨酸-β-酯酸酐可以通过在P2 O5 、三氯化磷、酸酐等存在的条件下通过缩合两分子的N-(3,3-二甲基丁基)-L-α-天冬氨酸-β-酯形成。④通过N -(3, 3 -二甲基丁基)- L-α-天冬氨酸-β-酯羰基酸酐和L-苯丙氨酸甲酯缩合来制备。N-(3, 3 -二甲基丁基)-L-α-天冬氨酸-β-酯羰基酸酐可以通过N-(3, 3-二甲基丁基)-L–α-天冬氨酸-β-酯和碳酰氯反应而制得。立体选择性催化氢解纽甜酯的脂肪酶或酯酶可以通过曲霉(Asperg illusniger)，米曲霉(Asperg illusoryzae)，南极洲假丝酵母(Candida antarctica)，柱状假丝酵母( Candida cylindracea )，产朊假丝酵母( Cand ida utilis)，娄地青霉( Penicillium roqueforti)，洋葱假单胞菌(Pseudom onascepacia) , 少根根霉(Rhizopus arrhizus)，水生嗜热杆菌(Thermus aquaticus)，小麦胚芽，假单胞菌(Pseudomonas sp) , B型假胞菌(Pseudomonas sp. type B) ，芽孢杆菌( Bacillus sp) , 嗜热脂肪芽孢菌(Bacillus stearothermophilus)，猪肝，马肝，兔肝，酿酒酵母( Saccharom yces cerevisiae) 等等这些微生物获得。一般脂肪酶首选从B型假单胞菌( Pseudom onas sp.type B )，酯酶首选从猪肝提取。纽甜酯和酶的混合物加入乙腈的0.1M-0.4M的NaH 2 PO4缓冲溶液中，在pH 5.5- 8.0、温度22-40℃的条件下反应2-48h。反应体系中的溶剂、pH、缓冲溶液的浓度和反应温度都会影响酶的活性，但对酶的选择性的影响比较小。反应过程中乙腈等的有机溶剂的比重不能超过50%，如果超过溶剂体系会使酶发生改性而降低水解率。反应温度的升高会使反应的速率加快，但会使反应的选择性有一定的降低，反应最佳温度应控制在22-40℃。

用酶化学的方法制备纽甜可以更进一步地通过固定化酶的技术把脂肪酶或酯酶固定在硅胶、次乙酰塑料(Celite)、DEAE-Sephadex、CM Sephadex等其他类似的固定相上。实现酶的固定化，这样不仅可以很方便地实现酶的循环利用，还可以很容易地分离酶和产品。这使酶化学生产纽甜有着更大的优势。

4 纽甜的代谢途径

纽甜的代谢途径有2条，

主要通过A代谢途径进行，绝大部分纽甜经过该途径转化成脱酯衍生物并短时间排出体外；B途径为次要代谢途径，这个过程中脱酯衍生物（DWB-Asp-Phe）的二甲基丁基部分被氧化生成二甲基丁酸，随尿液中排出体外.对于B途径所产生的甲醇和苯丙氨酸，因其含量小，不必担心安全性例如，在食品中添加甜度相当于10%的葡萄糖溶液的纽甜（约17毫克），理论代谢后生成甲醇量为1.37mg/L，比番茄汁中的甲醇量低220倍（每升），对人体无害.代谢产生的苯丙氨酸的量为7.08mg/L，低于果汁中的含量（90-100mg/L），也低于门冬氨酸代谢所产生的量（290mg/L）,而纽甜实际代谢后产生的苯丙氨酸仅为0.7mg/L，所以说这种甜味剂是十分安全的[22].

参考 献略

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