赛说上游 |?用于高密度灌注培养的增强型 一次性生物反应器

引 言

一次性系统的改进使得在新兴的生物工艺工作流程中可以进行高密度培养，而培养基优化和克隆基因筛选的进步凸显了旧式一次性生物反应器（S.U.B.）的性能限制。本研究介绍了通过对Thermo Scientific? Hyperforma? S.U.B. 的空气分布器和搅拌系统进行战略改进，使之与传统的S.U.B. 设计相比，混合和传质性能有三到四倍提升的空间。本研究考察了以下内容：

• 以中试规模（50 L）到生产规模（500 L）的工作容积中的灌注应用为目标，考察生物反应器特性、Thermo Scientific? TruBio? DeltaV? 控制器优化、在线工艺分析和 S.U.B. 的可放大性分析。
• 保持适当的操作参数，得到了高密度培养结果（大于260 × 106 细胞/mL）。新的数据证实了：50 L S.U.B.在配备了一个专门的钻孔式空气分布器（DHS）、一次性泡沫探测器、以及超大的叶轮后能够提高整体S.U.B. 操作效率的。结果还包括如何保持接近理想的溶解二氧化碳环境、减少顶部的泡沫产生、降低总剪切水平，从而获得极佳的细胞活力的具体建议。

这项工作还证明可以通过一次性工艺降低技术风险、减少劳动力和简化工艺组件技术转换，实现最佳方法和理想的工艺效益。当用于高密度种子培养强化或作为以每天1-2 个容器体积（VVD）的合理培养基更换率操作的紧凑生产规模生物反应器系统时，该工作提供了关于连续处理的优点的进一步证据。

目 标

增强型HyPerforma S.U.B.使得传质大幅增加，最终可使细胞培养达到极高的密度。增强型S.U.B. 系统已经在50 L 到500 L 的范围内进行灌注技术优化，在该范围内，细胞生长和高蛋白产量可以在培养基更换率和体积方面达到经济平衡。通过在这个体积范围内的灌注和 1-2VVD 的标准培养基更换率，可以在使用更小容器的情况下每年得到成吨的产品。

此外，在这些小容器中进行灌注对于N-1 生物反应器是非常有效的，因为它可以作为种子输送到更大的生产反应器。数据显示，在所有增强型的S.U.B. 中，传质速率都非常高，最终使得50L S.U.B. 中达到超高细胞密度。

S.U.B. 设计

表1.增强型HyPerforma S.U.B.表1 给出了对传统HyPerforma S.U.B. 的改进，将其适用于需要更高传质和更自动化的灌注系统。

图1. 从50 L 到500 L灌注培养，传统型和增强型 S.U.B. 的功率输入体积比（PIV）与混合速度的关系

材料和方法

使用标准动力学方法[2]在所有容器中进行了传质研究，其中氧从气相到液相的转移表示为：

式中kLa 为体积传质系数，Co2 为溶解氧浓度，C*O2 为溶解氧饱和浓度。用氧（空气）转移到氮气饱和溶液中的kLa 来测量氧的传质。从溶液中转移出的二氧化碳的传质，用氧气（空气）转移到二氧化碳饱和溶液中的kLa 来测量。

测试溶液由1 g/L 泊洛沙姆188 和3.5 g/L HEPES 缓冲液组成，在空气饱和和37°C 下滴定至pH 7.25。在通过DHS 的不同气体流速和几个计算好的功率输入（np=2.1）条件下进行测试。

细胞培养试验

细胞培养是在50 L HyPerforma S.U.B. 中以40 L 的工作体积进行的，并与Repligen XCell? ATF 6 系统整合。本研究中测试使用了与最终空气分布器设计相比性能较低的DHS 原型。CHO DP-12 细胞（ATCC，编号：CRL-12445），适用于LONG? R3 IFG-1 生长因子；以0.4 x 106 细胞/mL 接种于添加了100 ng/mL LONG R3 IGF-1 和4mM Gibco? GlutaMAX? 的40L Gibco? CD OptiCHO? AGT? 培养基中。表2 列出了S.U.B. 的运行条件。表3 列出了XCell ATF 6 系统的工作条件。离线测量细胞计数、营养物质、代谢物、电解质和蛋白质产量。

表 2. 50 L HyPerforma S.U.B. 运行条件

表 3. XCell ATF 6 系统的工作条件

希望实现自动化控制整个培养过程中的大多数参数，以确保高成功概率。为此，将以下组件集成到DeltaV 控制器中：

• 标准一次性DO 传感器、pH 传感器和温度传感器。
• 泡沫传感器自动防泡沫输送和控制泡沫水平。内置泡沫控制与消泡泵相连，根据需要输送消泡剂，以减少总消泡剂用量。
• AberTM 细胞密度传感器。Aber 发射器的信号被集成到DeltaV 控制器中，并且根据需要，可以连接一个泄放泵，根据测量的细胞密度，循环打开和关闭，以保持目标细胞密度。
• S.U.B. 称重传感器保持目标体积。使用简单的Heaviside 方程建立计算模块，并与培养基添加泵相连，以避免向S.U.B. 注入过多或不足的新培养基。

在1,000 L Thermo Scientific? HyPerforma? 一次性搅拌机（S.U.M.）中配制培养基，无菌过滤到1,000 L S.U.B. 中，用TCU保持在小于8°C。将工艺中的废培养基转移到 1,000 L ALLpaQ? 容器中。

氧气作为主要气体，通过DHS 进行传质。使用这种流注，溶解氧设定点很容易保持，在气体流速范围内具有可扩展的传质性能，同时达到足够的CO2 溶出水平。

结 果

传质测试

图2 展示了仅使用DHS，在最大推荐叶轮速度下（传统系统为20 W/m3，增强型S.U.B. 为100 W/m3），增强型S.U.B. 的O2 和CO2 的传质结果以及传统S.U.B. 的O2 传质结果。虽然传统系统的kLa 接近10–13/hr 的极限，但增强型S.U.B. 的结果显示，仅使用DHS 的kLa 增加了三到四倍。

图2. 传统与增强型S.U.B. 的O2和CO2 的传质结果比较

在较大的S.U.B. 中，DHS 的氧气传质较高，因此使氧气和空气流速与搅拌速率平衡，在所有容器尺寸上实现所需的氧气和二氧化碳传质。重要的是，DHS 在不同容器尺寸、气体流速和混合速度上的CO2:O2 传质比保持在0.3 到0.5 之间。这一比例非常适合平衡氧气需求，同时保持足够水平的CO2 溶出，以保持生理范围（30-80mmHg）内的dCO2 水平[3,4]。

细胞培养测试

细胞培养在50 L S.U.B. 中进行，以测试系统能力，包括S.U.B. 和为实现超高细胞密度采用XCell ATF6 一次性系统的控制器。在反应器内接种0.4 x 106 细胞/mL，将目标细胞密度培养到40、100、150 和200 x 106 细胞/mL。在200 x 106 细胞/mL下培养两天，最终目标是对灌注系统进行压力测试。因此，有目的地允许细胞无限制地生长，达到大于260 x 106 细胞/mL，增加灌注率以支持细胞生长。根据需要补充葡萄糖，在培养基中维持在1-3 g/L。当26 天后 ATF 单元完全失效，运行最终终止。活细胞密度（VCD）和培养的存活率如图3所示。

图 3. 在 1–4 VVD 下运行的增强型 50 L S.U.B. 的 VCD 和存活率结果。稳定状态细胞密度区域已标记

培养控制器设定点在整个运行过程中保持不变，包括30±4%的溶解氧、37±0.05°C 的温度和7±0.20 的pH 值。此外，离线测量其他培养参数，并用于确定适当的培养基交换和葡萄糖喂养率。绘制在图4 中的这些值显示葡萄糖水平在1-3 g/L，乳酸和氨的积累最小。

图 4. 培养过程中反应器中的葡萄糖(Gluc)、乳酸(Lac)、谷氨酰胺(Gln)、铵(NH4+) 和钠离子(Na+) 水平。

单独进行了小规模测试，显示了该细胞系在极端混合条件下（尖端速度超过1.5 m/s，功率输入大于400 W/m3）的良好活性。在观察氧气流速和对dCO2 的影响时，偶尔将搅拌功率输入调整到20-100 W/m3（图5）。数据表明，功率输入、气体流量、VCD 和dCO2 之间存在明显的相关性，有待进一步探讨。

图 5. 50 L 细胞运行的搅拌、dCO2、VCD、和氧气流速

质量平衡模型

氧气质量平衡

献已经建立了搅拌罐反应器中使用氧气转移率（OTR）、细胞密度、混合功率、气体流速和喷射气体的分压进行细胞培养的经验和理论模型[2,5]。因此，从培养数据中建立了一个模型，将kLa与单位体积的功率输入、气体流量和基本代谢传质方程联系起来，如下所示。

简言之，在稳态培养中，OTR 等于细胞的氧摄取率（OUR）。因此，细胞密度与氧气传质系数（kLa）乘以喷射气体和培养物中的设定工作溶解氧（DO）分压差成正比。在这里，kLa 如图所示进一步被建模为PIV、气体流量 (VVM) 和模型系数的结果。

从这个模型（图6）可以看出，预测和观察到的VCD 之间存在直接的相关性，这意味着培养条件（气体流速、混合速度和喷射气体的浓度）可以针对工艺要求，以达到所需的细胞密度。这使S.U.B. 成为一个理想的平台，利用预测的培养条件，来达到理想的生长和产出。

图 6. 模型预测 VCD 与实测 VCD

CO2质量平衡

同样，可以从培养数据中模拟dCO2 和pH，来证明平衡工艺参数的有效性。可使用以下公式计算pH 值：

pH =基线 pH – 酸积累+ 碱积累

基本上，每种培养基都有一个基线运行pH 值，并且受诸如乳酸、铵、氨和二氧化碳等废物的产生和消耗的影响。

此外，可通过反应器设置（如通过调整气体流速和搅拌以增加或减少工艺中发生的二氧化碳溶出量）来调整培养基的pH 值。上述方程用于生成基于dCO2 积累（酸积累的组成部分）的模型，来展示培养基中dCO2 的可预测性（图7），证实可以通过键入气体流速和搅拌来协助dCO2 控制（从而控制pH）。同时将实测pH 值与实测dCO2 进行对比，表明pH 值保持在工艺设定点内，但培养条件不同会有所不同。

图 7. 模型预测 dCO2 和实测 dCO2

讨 论

对传统的HyPerforma S.U.B. 进行了增强，以实现针对高要求培养（如在连续工艺应用中看到的）的最佳性能。这些改进主要集中在叶轮和DHS 的配置和设计上，在50–500 L 的容器尺寸上改进了混合和传质性能。此外，在保持比例参数（如PIV 和气体流速）的前提下，这些改进可以轻松调整不同容量的工艺，特别是使用增强型DHS 时。

更重要的是， DHS能够在不使用烧结式气体分布器作为传质辅助的情况下实现传质的大幅度增加。先前的测试表明，烧结式气体分布器在高密度或长时间培养中有积垢倾向，由于烧结式气体分布器表面气泡形成的变化，导致性能高度变化且通气效果大量损失。而DHS 由于具有低细胞剪切应力和高kLa 的优点，对细胞碎片污染具有很高的抵抗力，在高需求条件下显示出强劲的性能。

通过广泛测试产生的 O2 和CO2 传质数据表明，这些参数在特定容器尺寸以及跨容器尺寸具有可预测性和可扩展性。这些改进显示了比传统系统高出三到四倍的性能，同时将混合和喷射保持在推荐的反应器设置范围内。在低的气体流速下也实现了这些传质的增加，从而降低了泡沫水平和通气成本。

进行了一次验证性的细胞运行，以突出这些混合和传质增强的效果，在不同的设定点达到高达200 x 106 细胞/mL 的稳定细胞密度，最终达到260 x 106 细胞/mL。虽然由于过滤限制和克隆稳定性，大多数工艺不需要如此高的细胞密度，但这些数据表明，S.U.B. 能够支持非常高需求的培养。

值得注意的是，在培养过程中，许多关键的反应器设置几乎完全自动化，包括基于称重传感器的自动培养基输送；基于一次性泡沫传感器的所需消泡剂的投放；基于DeltaV 控制器内集成细胞密度探测器的目标细胞密度的细胞泄放；气体控制达到0.2 VVM，以将DO 水平维持在设定点。这种自动化使得即使在需要超高细胞密度的苛刻条件下也能成功完成细胞培养，而用户需要的投入也很小。

从细胞培养数据中生成传质模型，可显示混合功率和气体流量对预测培养过程中活细胞密度和dCO2 水平的影响。虽然每个培养物、培养基、细胞系和工艺都会显示出固有的多样性，但数据表明，建模可以帮助实现理想的生长条件，并允许终端用户根据需要键入参数。通过集成其他传感器（dCO2, Raman），控制混合速度、气体流速、入口气体浓度和灌注速率，可以实现进一步的自动化，以监测和控制dCO2、葡萄糖和乳酸的水平。

结 论

在50-500 L S.U.B. 中混合和通气的策略性增强使得氧气传质增加3-4倍，以支持超高需求的培养，如灌注生物工艺中的培养。传质数据显示了S.U.B. 的可扩展性，允许在从N-1 种子培养到大一些的生物反应器，高细胞密度种子库或到500 L 生产规模上实现灌注工艺。

在50 L S.U.B. 中执行高度自动化的细胞运行，产生的细胞密度超过260 x 106 细胞/mL，在灌注率高达4 VVD 时维持适当的反应器条件，包括DO、 pH 和 dCO2 水平。结果表明，即使在超高细胞密度的苛刻条件下，S.U.B. 和控制器仍能有效地维持合适的细胞培养环境，并且能容量将进一步提升。

实际的培养基交换率下的最佳培养基选择和运行无疑是物流和财务的重要考虑因素。最重要的是，这项研究证实了当实现完全集成和可定制的一次性工作流解决方案时，由于其显著提高工艺效率、快速设置和显著降低技术风险的潜力，使用Thermo Scientific S.U.M.、S.U.B.、补料容器、BPC和一次性液体输送管路，可以获得实在的效益。

参考 献

1. Zhu Y, Cuenca JV, Zhou W et al. (2008) NS0 cell damage by high gas velocity sparging in protein-free and cholesterol-free cultures. Biotechnol Bioeng 101, 751–760.

2. Doran PM (1995) Mass transfer. In Bioprocess Engineering Principles. pp.190–217. Elsevier.

3. Zhu MM et al. (2005) Effects of elevated pCO2 and osmolality >Biotechnol Prog 21, 70–77.

4. Mostafa SS, Gu X (2003) Strategies for improved dCO2 removal in large-scale fed-batch cultures. Biotechnol Prog 19, 45–51.

5. Garcia-Ochoa F, Gomez E (2009) Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in microbial processes: An overview. Biotechnol Adv 27, 153–176.

1. Ben Madsen, Senior Engineer, Process Development, Thermo Fisher Scientific

2. Jordan Cobia, Engineer I, Systems Design, Thermo Fisher Scientific

3. Nephi Jones, Senior Manager, Research and Development, Thermo Fisher Scientific