PCR引物合成回来，设置PCR扩增程序的时候，退火温度应该用多少？这是大家伙经常会遇到的比较头疼的问题。
另外，通过软件设计引物的时候有个Tm值，引物合成回来，单子上也有个Tm值。那么用哪个温度好呢？用合成单上的这个温度是最佳温度吗？
写在开头
不论是通过软件计算还是引物合成公司提供合成服务所提供的Tm值都是通过软件计算得出的理论退火温度，引物退火温度是个经验公式，不同软件之间略有差别。
像我们最常用的软件Primer 5 和 Oligo 6，两个软件的Tm估算方式不一样，各有其优点。另外还有一些在线的设计 站，也可参考。
当然有偏差是正常的，具体的还需要实践，并根据实际实验条件才能确定。
Tm值计算方法有以下三种：
方法一：2AT+4GC方法：
Tm=4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
这是最简单的计算Tm值的一种方法，即每增加一个A或者T，Tm值就增加2℃；每增加一个G或者C，Tm值就增加4℃。一般认为适用于长度小于20mer的寡核苷酸序列。
方法二：%GC方法
1. DNA-DNA
2. RNA-RNA
3. DNA-RNA
方法三：最近邻的方法
其中，?H和?S分别代表双螺旋形成的焓和熵，
R表示摩尔气体常数(1 .987 cal/℃× mol)，
C表示探针或引物浓度，寡核苷酸为非对称序列时，一般采用C/4来取代C。
引物设计软件Oligo 6 同时给出了上面三种Tm值计算结果。
引物设计软件Primer 5 采用最近邻方法，公式为Tm=?H/(?S+R×ln C)，并未进行校正。
这么多公式是不是有点晕，其实放在那里就好，不用理会，我们只需要知道算法是怎么来的，然后利用软件达到实验目的就可以了。
其实现在有很多可以使用的小软件。例如某虫论坛就有人分享类似的软件，童鞋们一搜便能找到。像Primer 5 和 Oligo 6这样的等等。
当然也有在线计算Tm值的 站，举个例子：
1、选择DNA聚合酶类型
2、键入引物序列
3、选择引物浓度
然后推荐的退火温度就出来了，可以参考执行。
纸上得来终觉浅，绝知此事要躬行。退火温度还需要实验去验证！
这就需要用到梯度PCR仪来帮你找到最适的Tm值。
传统梯度 PCR 仪是怎么做的
传统的梯度PCR仪的结构都是在均匀的金属加热模块下方有2个独立的加热/冷却元件，这种设计使得只能设置2个温度，通过热传导在样品基座上形成温度梯度，最终形成的曲线多呈S形，而不是线性。
由于不能准确设置每一列的温度，退火温度时间设置长短对梯度温度的影响很大。不同列之间的温差大小不一，这就意味您的最佳退火温度是不够精确的。
这让苦苦挣扎于最适退火温度的科研小哥怎么不崩溃！明明是为了获得最佳的退火温度，进行梯度控温设置。现在却发现获得的温度还不够准确。
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每次热学作用和边缘效率总是造成空间差异。这次，我将每对加热/冷却元件和金属加热模块进行改进，互相隔离。
常规梯度PCR在基座上形成的温度梯度和边缘效应，导致了孔间温度差异。6个独立设置温度的模块，影响扩大了可设置的最大温差。使相邻的模块间温度干扰最小化。
在此基础上，为了简化繁琐的编程步骤，我们还提供彩色触控屏界面。快速和标准PCR两种模式任选，最快节省PCR循环时间。VeriFlex?只为真正实现线性梯度控温！
写在最后
其实很多实验员都会发现，做实验也没那么多规矩，做出来的结果都很好，而且这么多年都是这样过来的，没什么问题。由于结果顺利，反而会认为一些错误的操作是正确的。其实PCR实验可以很粗犷前提是你要对实验的原理、机制、方法都全面掌握。开个玩笑就算你用的是三个水浴锅加一个计时器，做PCR也能一做一个准。
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