在气体扩散室中实施 pH 微传感器和微型宽范围分光光度计有助于对血氧结合特性进行 pH 依赖性分析。在冷冻温度下，仅微量无缓冲血液中的 pH 值和色素吸光度的平行记录产生了高度分辨的氧平衡曲线。
图 1：章鱼血淋巴的 pH 值对色素氧化变化的反应。348 nm 处的峰值吸光度标志着章鱼的血色素血蓝蛋白在暴露于 21 或 0 kPa 氧分压后的氧化状态。
一个多世纪以来，研究人员开发和改进了设备来评估和理解氧气运输的复杂生理学，从而产生了目前采用的各种方法 [1]。然而，尽管技术取得了进步，但方法学上的挑战仍有待解决，尤其是研究环境对非模式生物的影响的生物学家所面临的挑战。这些挑战包括：
(1) 血氧结合分析需要控制或监测各种因素，例如温度、二氧化碳，特别是 pH 值。然而，由于色素本身吸收或释放质子，pH 值会随着血液色素氧合的变化而变化（图 1）。在实验过程中添加缓冲液可稳定 pH，但可能会掩盖或扭曲氧气转运对此类 pH 变化的相关反应体内[2]。因此，对氧转运的全面了解需要同时监测血液 pH 值以及无缓冲血液中的色素氧合 [3]。
(2) 由于小生物、有问题的血管或活体样本的二次取样，样本量通常仅限于几微升。然而，许多设备每次测量都会消耗大量样品（> 400 μL），这也是由于传统 pH 电极对体积的要求增加，因此限制了实验重复或测量参数的数量。
(3) 在低实验温度 (< 5 °C) 下，常规 pH 电极由于不稳定且响应缓慢的信号而性能不佳，这妨碍了例如极性生物的血液功能分析。为了克服这些挑战，我们配备了由 Niesel 和 Thews [4] 以及 Sick 和 Gersonde [5] 设计和描述的气体扩散室（Eschweiler Co., Kiel, Germany），配备 PreSens pH 微传感器和微型宽范围分光光度计。
图 2：改进的扩散室的概述和横截面，说明了 PreSens pH 微传感器的实施。（图根据 Oellermann 等人 2014 年修改）。
图 3：安装在塑料支架上的 PreSens pH 微传感器的详细图示，该塑料支架被移动到扩散室中心的气密室中。注射器针头通过密封环插入，传感器尖端移动到位于石英玻璃板上的样品液滴中（图，Oellermann 等人，2014 年）。
图 4：通过在 0° 下增加 pCO2 (0 - 25 kPa)，在从高到低的四种不同 pO2 (21、13、4、1 kPa) 下测量的南极章鱼 Pareledone charcoti 血淋巴的高分辨率氧平衡曲线C 实验温度（照片：Armin Rose）。
材料与方法
技术修改
气体扩散室通常用于通过监测响应于氧气、二氧化碳和氮气浓度变化的特征波长处的吸光度变化来评估微小血液样品的血氧结合。我们对气体扩散室进行了改造：(1) 通过光纤电缆和准直透镜将数字微型宽范围分光光度计和氘卤素（即紫外线和可见光）光源（德国海洋光学公司）直接连接到气体扩散室的上方和下方。血液样本引导光束穿过样本液滴；(2) 并通过如下方式实施 pH 微传感器（PreSens，德国）（图 2）：通过将圆柱形通道铣削到样品玻璃支架中并通过塑料螺钉固定来安装 pH 微传感器的注射器外壳（图 3 , DPMA 专利号 10 2013 011 343)。覆盖传感器的钢针略微弯曲（约 160° 角）以确保传感器尖端进入液滴。然后将针插入硅胶环，传感器尖端移入样品液滴的边缘，以避免光束过度漂白。硅胶环允许 pH 微传感器进入气密室而不会导致气体泄漏。
血液功能分析
对 2012 年 3 月在 RV Polarstern 游轮上采集的南极章鱼的无细胞血淋巴进行了血液功能分析。每次测量之前，pH 微型传感器在用 40 mmol L-缓冲的六种海水标准 (6.7 - 8.1) 中进行校准1 MOPS（3-（N-吗啉代）丙磺酸）在 0 °C 下使用 Tris 缓冲海水标准品（Dickson，CO2 QCLab，USA）将 pH 值校正到自由水垢 pH 值。将血淋巴在冰上解冻，与 0.8 μL 的 0.2 mmol L -1 NaOH (10 μmol L -1最终浓度）以将 pH 值提高到 8.0 以上，然后将 15 μL 涂在玻璃板上。为了校准氧气平衡曲线，在 100% 氧气时记录最大吸光度，通过回归分析计算出最小吸光度 [6]。在恒定的氧分压 (pO 2 , 21, 13, 4, 1 kPa) 和不断降低的二氧化碳分压/pH (pCO 2 , 0 - 10 kPa / 大约 pH 8.1 - 6.8) 下进行测量。
无缓冲章鱼血液的吸光度和 pH 值测量
通过改进的气体扩散室，我们能够分析仅微量无缓冲血淋巴中南极章鱼血蓝蛋白的 pH 依赖性氧合（图 4）。仅以适中的记录间隔（每 30 秒测量一次）连续和同时记录吸光度和 pH 值，得到高度分辨的氧平衡曲线。150 μm 的小探头直径允许探头尖端完全浸没在 15 μL 样品液滴中。由于缺乏止血，传感器尖端处的蛋白质堵塞，因此在八足动物血液中没有发生信号干扰。与 pH 电极不同，pH 微传感器在 0 °C 实验温度下提供稳定且快速响应的 pH 记录（图 4）。颜料氧化以 S 形方式向较低的 pH 值下降，强调了典型的头足类血蓝蛋白氧合的 pH 依赖性 [3]。南极章鱼血液在 0°C 时表现出高氧亲和力，其标志是在低 pH 值和低氧分压下不完全卸载氧气（图 4）。
结论
PreSens pH 微传感器和微型宽范围分光光度计在气体扩散室中的实施克服了功能性血液分析中当前的方法学挑战，特别是在评估微量无缓冲血液中色素氧合的 pH 敏感性的实验生物学家所面临的挑战。沿 pH 梯度的重复测量可以在不同的氧分压和温度下运行，来自仅提供有限样本量的样本，而无需汇集样本。同时连续记录 pH 值和吸光度显着提高了数据分辨率，从而可以更详细地分析氧结合曲线。在冰冻温度下稳定且快速响应的 pH 信号促进了南极章鱼的血液功能分析，其血色素血蓝蛋白显示出高氧亲和力。未来的实施可能涉及 pO2或 pCO 2微传感器沿 pO 2梯度执行常规但精细分辨的氧结合实验，或评估 CO 2与血色素结合的 p
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